A principios de 1528 un grupo de españoles, procedente de Guatemala y encabezado por Pedro Portocarrero, fundó en las cercanías del antiguo Balún Canán un poblado que recibió el nombre de San Cristóbal de los Llanos, como punta de lanza de Pedro de Alvarado sobre las tierras chiapanecas. El intento fue frustrado por la presencia de Diego de Mazariegos, llegado desde México por las mismas fechas, y quien estableció Ciudad Real, hoy San Cristóbal de las Casas, como la única población española y capital de la provincia. Como fruto de 01a concertación entre ambos grupos, San Cristóbal de los Llanos fue desmantelado y varios de los compañeros de Portocarrero se establecieron como encomenderos en Ciudad Real. Posiblemente la leyenda que habla de un puma que guió a los españoles para fundar su ciudad junto a un manantial, aluda la creación de ese efímero poblado.

Establecido el sistema colonial, Comitán, pueblo de hablantes de tzeltal, cavil, coxoh y tojolabal, pasó a ser encomienda de Diego Holguín, mientras que los asuntos de la República de Indios estaban a cargo de un cabildo, cuyo primer gobernador fue don Luis de Velasco. Fundamental fue la presencia de los dominicos, llegados a mediados del siglo xvi, que establecieron en el poblado uno de sus conventos principales del que dependían Zapaluta, Coapa, Coneta, Aquespala, Escuintenango, Comalapa, Chicomuselo y Yayagüita. Los frailes también establecieron las primeras haciendas en Los Llanos, que por eso se conoció como La Frailesca de Comitán.

En el siglo XVII, el fraile Thomas Gage escribe que «El priorato de Comitán posee diez pueblos y muchas haciendas, donde pace una inmensidad de ganado vacuno, caballos y muías». En efecto, ya para entonces Comitán era muy importante por la producción de sus haciendas, que había significado el traslado de españoles dueños de las estancias a residir en el poblado que, sin embargo, siguió siendo considerado «pueblo de indios» hasta principios del siglo XIX.

Durante el siglo XVII, el proceso de ladinización, es decir de presencia no indígena, se incrementó, no solamente por las haciendas sino porque Comitán era un lugar de paso muy importante sobre el Camino Real, ya que para entonces el ramal de la tierras bajas que pasaba por Copanaguastla y Coapa había caído en ruina a causa de las epidemias y también funcionaba como una de las entradas de la Selva Lacandona, región casi incógnita durante todo el periodo de la colonia. Comitán poseía la ventaja sobre la capital provincial, Ciudad Real, de estar más cercana y accesible a Guatemala, de donde Chiapas dependía en aquella época.